Químicos de la Universidad de Utah han ideado un nuevo método para detectar el daño químico al ADN que, a veces, conduce a mutaciones genéticas responsables de muchas enfermedades, incluyendo varios tipos de cáncer y trastornos neurológicos.
«Estamos un paso más cerca de comprender la química subyacente que conduce a enfermedades genéticas», dice Cynthia Burrows, distinguido profesor y presidente de Química en la universidad y autor principal de un nuevo estudio publicado este mes en la revista online Nature Communications. «Tenemos una forma de marcar y copiar la localización del daño de ADN para que podamos conservar la información de dónde y cuál fue el daño.»
Ene Riedl, de la Universidad de Utah, becario postdoctoral y primer autor del estudio, dice que 99% de las lesiones del ADN – daño a las bases químicas conocidas como A, C, G y T que ayudan a formar la doble hélice del ADN – son reparados de forma natural. El resto puede dar lugar a mutaciones genéticas, que son errores en la secuencia de bases y pueden causar enfermedades. El nuevo método puede «identificar y detectar la posición de las lesiones que conducen a las enfermedades», dice.
Burrows dice:. «Estamos tratando de buscar los cambios químicos en la base, que pueden inducir a la célula a cometer un error, una mutación. Uno de los aspectos poderosos acerca de nuestro método, es que podemos leer más de un solo sitio dañado, y hasta a docenas, en la misma cadena de ADN «.
Los químicos dicen que su nuevo método permitirá a los investigadores a estudiar los detalles químicos de las lesiones del ADN o daños. Estas lesiones, si no se reparan de forma natural, se acumulan con el tiempo y pueden dar lugar a mutaciones responsables de muchas enfermedades relacionadas con la edad, como el cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de pulmón y cáncer de piel melanoma; arterias obstruidas; y enfermedades neurológicas tales como la enfermedad de Huntington y la enfermedad de Lou Gehrig.
«Un método capaz de identificar la identidad química y la ubicación en la que las lesiones aparecen, es crucial para determinar la etiología molecular [causa] de estas enfermedades», según Burrows y sus colegas del estudio.
La investigación fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud. Burrows y Riedl realizaron el estudio con la Universidad de Utah y el químico Aaron Fleming, profesor asistente de investigación, y Yun Ding, investigador postdoctoral.
El ADN es una molécula, en forma de una hélice de doble cadena que contiene las instrucciones genéticas que los organismos vivos utilizan para desarrollar su función y reproducirse. Cada hebra está hecha de numerosas copias de cuatro bases químicas – A, C, G y T – unidos por una cadena principal de azúcar y fosfato. Cuando dos hebras están conectadas en una doble hélice, sólo dos tipos de pares de bases pueden formar CG (o GC) y AT (o TA).
El nuevo método para encontrar las lesiones del ADN combina otras, de las técnicas existentes.
En primer lugar, los investigadores al encontrar el daño, lo aislan fuera del ADN, de la misma forma que una célula hace naturalmente, utilizando lo que se llama «la reparación por escisión de base,» – el descubrimiento que ganó Tomas Lindahl, científico en Inglaterra, el Premio Nobel de Química.
En segundo lugar, un «innatural par de bases» se inserta en el sitio de daño en el ADN cortado con tijeras de salida para etiquetarlo. En lugar de pares de bases naturales CG y AT, los químicos de Utah usaron un llamado tercer, o no natural par de bases, inventado por los químicos en el Instituto de Investigación Scripps en California. Burrows dice que su estudio demuestra el primer uso práctico de esa invención.
En tercer lugar, el ADN con el sitio de daño marcado por un par antinatural de tercera base, se amplificó a continuación, o millones de veces, utilizando un método existente conocido, llamado PCR o reacción en cadena de polimerasa, que las copiará. Burrows dice que la innovación clave del nuevo estudio fue utilizar la reparación por escisión de base, para cortar a cabo el daño y luego insertar el par de bases no natural en el sitio de daño, por lo que es posible hacer millones de copias del ADN – un proceso que normalmente era impedido por el daño.
En cuarto lugar, otra etiqueta química, llamada 18-corona-6 éter, se fija a la par de bases no naturales en todas las cadenas de ADN, que luego leen el secuenciado utilizando un tipo de secuenciación de nanoporos desarrollado hace algunos años por Burrows y Utah, por el químico Henry White. Dicha secuencia consiste en determinar el orden y la ubicación de las bases de una cadena de ADN – incluyendo los sitios de daño marcados por las bases no naturales – al pasar el hilo a través de un poro-molécula grande o nanoporo.
Las personas nacen con su genoma, o mapa genético de 3 mil millones de pares de bases «, y luego pasan cosas», dice Burrows. «Hay daños causados por el estrés oxidativo, debido a la inflamación y la infección, el exceso de metabolismo o químicos ambientales.»
El nuevo método busca «detalles moleculares que definen cómo nuestro genoma responde a lo que comemos y el aire que respiramos, y termina siendo saludable o no», dice.
Lesiones del ADN ocurren más de 10.000 veces al día en una sola célula humana. Una lesión puede ser una base que falta, una base que ha cambiado químicamente, o una ruptura en la columna vertebral del ADN. Que muchas lesiones pueden parecer mucho, pero con 3 mil millones de pares de bases en el genoma de una sola célula, el daño sólo afecta a aproximadamente uno de cada 300.000 pares de bases.
Los químicos probaron su método en un gen llamado KRAS que, cuando muta, puede causar cáncer de pulmón o de mama.
Burrows dice que la mayoría de los métodos de secuenciación de ADN revelan mutaciones debido a los métodos de lectura de las bases A, C, G y T. Cuando la secuenciación revela una de esas bases fuera de lugar, es una mutación. «Sin embargo, lo que no sabes es lo que la química – qué modificación – hizo que esta mutara», dice ella,
Pero los científicos no pueden encontrar una sola hebra de ADN en una solución en un plazo razonable. Tienen que hacer millones a miles de millones de copias del ADN para que puedan secuenciar y localizar el hueco donde estaba el daño. Pero el daño en sí es «un choque de trenes» que, o bien impide hacer copias del ADN o hace copias con errores, dice Burrows.
Así que una vez que la base dañada ha sido extirpada para crear un vacío, los químicos insertan el tercero o no natural par de bases AT, entonces se realiza el marcado en el sitio del daño, como una manera de etiquetar mientras que al mismo tiempo permite a millones de copias del ADN realizar el marcado.
Burrows dice que la innovación clave en el nuevo método es la utilización de la reparación por escisión de base y de pares de bases no naturales «para copiar el ADN y retener la información sobre el daño que estaba en la molécula original.»
Los químicos utilizan la amplificación por PCR para hacer millones de copias del ADN calentándolo hasta que las hebras de la doble hélice sean separadas. Las hebras se ponen en una solución con una gran cantidad de A, C, G y T nucleótidos – las bases unidas a las piezas de la columna vertebral del ADN. Una enzima polimerasa se une al extremo de cada cadena de ADN, y luego se mueve a lo largo de la hebra, agarrando T, G, C y los nucleótidos A para hacer una segunda hebra. Cada cadena de ADN se convierte rápidamente en dos. El número de hebras alcanza los millones en cuestión de horas.
«Necesitamos muchas, ya que, si sólo tenemos una molécula, no podemos encontrarla», dice Burrows. «Es como decir, ‘Hay un pez en el estanque; hay que tratar de atraparlo.’ Pero si hay un montón de peces idénticos, se puede tomar cualquiera de ellos y así vas a cenar «.
Una vez que los químicos tienen millones de hebras de ADN, con el daño marcado por un par de bases no naturales, que a continuación, utilizan la secuenciación de nanoporos para localizar el daño. Burrows dice imaginar la cadena de ADN como un largo trozo de hilo con una serie de nudos atados en ella, para representar lesiones de ADN marcadas. Coge uno de los extremos del hilo con una mano, y tira de ella a través de un par de dedos de la otra mano. Los dedos representan el nanoporo que detecta los nudos o daños a su paso entre los dedos.
Para ello, la secuenciación de nanoporos, los sitios de daño del ADN, que están etiquetados con bases no naturales, se etiquetan de nuevo con un producto químico llamado 18-corona-6 éter que, básicamente, hace que los «nudos» en el «hilo» de ADN sean más grandes y más fáciles de encontrar, como el la cadena de ADN que se mueve a través de una proteína en forma de poros bañadas en un líquido cargado eléctricamente. Los cambios en la corriente eléctrica permiten a los químicos detectar las bases A, C, G y T y las bases no naturales etiquetadas.
Encontrar las bases no naturales marcadas e identificar el sitio de daño en el ADN dentro de los 10 pares de bases. Burrows dice que el método de secuenciación de nanoporos necesita mejoras o reemplazo por secuenciación de próxima generación para identificar realmente los sitios dañados.
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